生物制品表征之蛋白质N端序列分析

随着现代医药工业的发展，蛋白质药物变得备受关注，而蛋白质药物的N端序列分析对于医药工业来说是非常重要的信息。N-端序列与蛋白质的功能和稳定性息息相关，对蛋白质进行N-端测序分析，可以确定蛋白质的起点，有利于帮助分析蛋白质的高级结构，揭示蛋白质的生物学功能。

百泰派克生物科技BTP为您提供多种蛋白质N端序列分析技术服务，基于埃德曼降解法的蛋白质N端序列检测、基于高分辨质谱法的蛋白质N端序列检测，详见如下介绍：

一、基于埃德曼降解法的蛋白质N端序列分析

1. 原理:

埃德曼测序反应是一个循环过程，即在弱碱性条件下使多肽/蛋白与异硫氰suānběn酯（PITC）反应，然后用suān处理，从多肽链上仅使氨基末端残基以氨基suān的běn基乙内xiān硫脲衍生物的形态游离出来，然后对分离出的氨基suān进行鉴定。

2. 实验仪器：

全自动蛋白质/多肽测序仪（PPSQ33A）

3. 应用：

埃德曼降解法测定蛋白质N端序列，通过跑胶转模或者点膜的方式进行样品处理，可以直接分析氨基suān信息，不需要任何蛋白质数据库就可以准确分析N端氨基suān序列，特别是能辨别异亮氨suān和亮氨suān、谷氨xiānàn和赖氨suān。但是埃德曼降解法的通量低，而且不适用于N端已被化学修饰或封闭的蛋白或者多肽不可用。

4. 结果展示：

为对19种PTH-氨基suān进行校准，故先测试19种PTH氨基suān的混合标准品，校准测试混合标准品图谱如下：

标准品校准测试图谱

PTH氨基suān混合标准品校准测试完成后，测试样品的N-端序列，样品测试图谱如下：

N端第1位

N端第2位

N端第3位

通过上述图谱可以确定蛋白质N端序列为Tyr-Val-Trp。

二、基于高分辨质谱法的蛋白质N端序列检测

1. 原理:

20世纪80年代末发展的电喷雾电离（ESI）使质谱技术在蛋白质结构分析上的应用发生了革命性飞跃。对于基于高分辨质谱法的N端测序，样品经过SDS-PAGE分离目标蛋白后使用蛋白酶酶解，酶解后产的产物用Q-Exactive系列质谱仪（Thermo Fisher Scientific）进行质谱分析，肽段在质谱中碎裂得到b、y离子的二级质谱图，通过图谱与蛋白理论氨基suān序列比对确定蛋白质的N端位置。

2. 实验仪器：

高效液相色谱串联质谱仪：高效液相色谱仪-Easy-nLC 1200；电喷雾-组合型离子阱Orbitrap 质谱仪-Q Exactive™ Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ Mass Spectrometer。

3. 应用：

基于高分辨质谱法的N端测序，可以通过高分辨率质谱分析N端封闭和翻译后修饰(PTMs)，从而确定蛋白质N端起点。对于复杂的蛋白，我司支持对复杂蛋白进行N端二甲基化标记，通过分析标记位置确定复杂蛋白样品中的多个蛋白的N端起点。

4. 结果展示：

蛋白药物样品的N端氨基suān序列分析：

Trypsin酶解后的样品经过LC-MS/MS分析后得到质谱数据，质谱数据经过与理论数据库匹配，得到和理论N端序列（HYAHVDCPGHADYVK）相符合的MS2图谱，图谱如下：

N端序列二级质谱图

通过以上分析可以得出此蛋白药物的N端起始氨基suān为组氨suān，N端序列为HYAHVDCPGHADYVK。

常见问题：

问题1：埃德曼降解法和质谱法检测蛋白质N端的优点与缺点？

回答：

质谱法：

优点：

1.能获取更长的N端序列信息；

2.可分析N端封闭和PTMs。

缺点：

1.等重的氨基suān不能确定；

2.肽序列的覆盖率很少是100%。

埃德曼降解法：

优点：

1.可以准确分析N端氨基suān序列，特别是能辨别异亮氨suān和氨suān、谷氨xiānàn和赖氨suān；

2.直接分析氨基suān信息，不需要任何蛋白质数据库，可以识别未登记在数据库中的未知蛋白质。

缺点：

1. N端已被化学修饰或封闭的肽不可用；

2. 低通量分析。

问题2：N端发生修饰的蛋白如何确定其N端位置？

回答：

在数据分析时同时分析N端的PTMs，分析鉴定出有修饰的N端位置。

百泰派克生物科技-生物药物表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司（Beijing Bio-Tech Pack Technology Company Ltd. 简称BTP）从事以生物质谱为依托的生物药物表征，大分子物质（包括蛋白质、多肽、代谢物）质谱分析以及小分子物质检测服务。
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