糖基化分析之糖基化位点分析

蛋白糖基化是一种在生物tǐ内发生的过程，通过糖基转移酶的作用，糖类化合物与蛋白质上的氨基suān残基形成糖苷键，从而将糖类化合物连接到蛋白质上。这个过程开始于内质网，然后在高尔基tǐ结束。经过糖基化修饰的蛋白质被称为糖蛋白。

糖基化对生物制品的疗效、稳定性和免疫原性有着重要的影响。其中，寡糖谱和糖链结构是评估生物制品特性的关键指标。作为重要的碳水化合物，寡糖参与蛋白质折叠和信号传导等多种细胞生命过程。此外，它们还经常与蛋白质结合形成糖蛋白。糖蛋白常位于细胞表面，参与细菌和病毒的识别以及凝集素等其他蛋白质的相互作用，对于生物制品的正常功能至关重要。

寡糖是非模板合成的，并具有树状结构，这增加了寡糖结构解析的挑战。为此，百泰派克生物科技BTP开发了一系列稳定、高效的液相色谱高分辨质谱（LC-MS/MS）表征方法。这些方法涵盖了从糖链分析到糖基化位点鉴定，再到糖肽解析的完整分析流程。通过这些方法，我们能够有效地研究和解析寡糖的结构和功能特性。糖基化分析基本流程图如下所示。

图1 糖基化分析流程图

一、生物制品N糖基化位点分析

1.原理

通过在重水中使用PNGase F来释放糖链并标记18O的方法，可以实现N-糖基化位点分析。shǒu先，根据蛋白质的理论氨基suān序列信息，选择适当的蛋白酶将蛋白质切割成肽段。待溶剂挥发后，我们在重水中进行切糖处理。然后，通过液相色谱-高分辨质谱技术，我们能够确定带有18O修饰的N-糖基化位点所在的肽段，从而确定N-糖基化的位置。通过比较修饰和未修饰肽段的质谱峰积分面积，我们还能够确定该糖基化位点的修饰效率。这些分析方法可以帮助我们深入研究和了解蛋白质的N-糖基化修饰。

2.实验仪器

• NanoLC: Vanquish NEO

• MS: Orbitrap Fusion Lumos

3.实验结果展示

图2 N糖基化位点二级图

注：图中N糖基化修饰在肽段第八位氨基suān上，分子量变化为+2.988，横坐标为质荷比，纵坐标为信号强度

二、生物制品O糖基化位点分析

1.原理

我们采用直接分析O糖肽的方法，进行O-糖基化位点分析。shǒu先，根据蛋白质的理论氨基suān序列信息，选择适当的蛋白酶将蛋白质切割成肽段。然后，通过液相色谱-高分辨质谱技术采集质谱原始数据。将这些数据导入O糖数据库，将O糖修饰作为可变修饰加入到数据分析中。zuì终，确定蛋白质中哪些位点发生了O糖基化修饰。通过这种分析方法，我们能够准确地确定O糖基化位点，从而深入研究蛋白质的糖基化修饰特征。

2.实验仪器

• NanoLC: Vanquish NEO

• MS: Orbitrap Fusion Lumos With ETD

3.实验结果展示

图3 O糖基化位点二级图

注：图中O糖基化修饰在肽段第五位氨基suān上，分子量变化为+365.132，横坐标为质荷比，纵坐标为信号强度

常见问题

问题1：如何在重水切糖中确定N-糖基化位点？

回答：N-糖基化位点是指发生N-糖基化修饰的氨基suān位点，该位点氨基suān的-NH2与N糖链的-COOH发生反应形成xiānàn键。在重水切糖的过程中，PNGase F酶会切断N-糖基化位点与糖链之间的xiānàn键。然后，重水中的-18O将与N-糖基化位点的氨基suān上的-NH2基团连接，从而完成对N-糖基化位点的标记。

问题2：糖基化通常发生在哪些氨基suān上？

回答：N-糖基化通常发生在天冬氨suān残基上，而O-糖基化通常发生在丝氨suān和苏氨suān残基上。这些氨基suān的特定位置在蛋白质的氨基suān序列中决定了它们是否容易发生糖基化修饰。

百泰派克生物科技-生物药物表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司（Beijing Bio-Tech Pack Technology Company Ltd. 简称BTP）从事以生物质谱为依托的生物药物表征，大分子物质（包括蛋白质、多肽、代谢物）质谱分析以及小分子物质检测服务。
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