氢氘交换质谱实验

随着生物医药技术的发展，蛋白质作为药物研究中的主要靶点或治疗制剂，逐渐被应用于临床各种适应症。蛋白质的结构是动态变化的，它会随着翻译后修饰、配体结合或蛋白质之间的相互作用而改变，因而在药物设计过程中研究蛋白质的高级结构变化对理解候选药物的作用方式及功能尤为关键。

氢氘交换质谱（hydrogen deuterium exchange mass spectrometry，HDX-MS）是一种研究蛋白质空间构象的质谱技术，其原理是当蛋白质用重水溶液稀释后，蛋白质分子中不稳定的氢原子和重水溶液中的氘原子进行交换，通过质谱监测肽段的质量位移。蛋白质结构中包含三种类型的氢原子：第一种是与蛋白质碳骨架共价结合的氢，这种氢不能进行氢氘交换反应；第二种为蛋白质侧链氢，其交换速率极快，溶液条件下很难对其进行监测；第三种是蛋白质骨架酰胺氢（即图中黄色标记部分，脯氨酸除外），其交换速率适中，且主链酰胺氢的交换速率与pH、温度、蛋白质的三维结构及构象动力学密切相关，因此HDX-MS实验通常监测这一部分氢的交换行为。

图1 蛋白质结构中三种类型的氢原子

HDX-MS实验一般包括5个基本步骤：

1、样品氢氘交换反应：将制备好的蛋白质水溶液用重水溶液稀释15～20 倍进行氢氘交换反应。高浓度的重水（90%以上）可以保证反应以氢原子向氘原子方向交换为主。

2、终止反应：通过将样品溶液pH值降至2.5、同时温度降至0℃来终止反应。

3、样品酶解：在终止条件下用固定化蛋白酶进行酶解（5～10 min），获得大量氘代肽段。

4、质谱检测：氘代肽段通过低温HPLC /UPLC分离，然后进入MS分析。根据氢氘之间的质量差异，MS可通过测定肽段质量中心位移来监测HDX变化。

5、数据分析：通过对质谱数据的处理和分析，可以得到蛋白质的氢氘交换速率和保护程度等信息。这些信息可以用来推断蛋白质的结构和构象变化，以及蛋白质与其他分子的相互作用等。

图2氢氘交换质谱HDX MS分析流程

与经典的蛋白质结构研究方法相比（X射线晶体衍射和核磁共振等），HDX-MS不能够提供精确的蛋白空间结构，它直接提供的主要信息包括哪些氨基酸序列位于蛋白质空间结构的表面位置（包括动态变化中的）、可能的活性位点和蛋白-蛋白相互作用位点等。但是HDX-MS有着其他经典方法不具备的优点：（1）可以进行蛋白质结构动态变化的研究，包括变化中的活性位点及表位；（2）在蛋白复合体构象的研究中具有独到的优势；（3）对样品需求量小、纯度要求相对较低、研究对象为溶液环境下的蛋白质的天然构象而非晶体中构象。

氢氘交换质谱实验作为一种重要的生物化学分析技术，目前已被广泛应用于蛋白质的结构、结构动态变化及蛋白质相互作用等方面的研究，与经典的蛋白质结构研究方法形成互补。百泰派克采用waters先进的nanoACQUITY UPLC HD-Exchange System分析系统，结合亚二纳米色谱颗粒填料，能够在不损失色谱分离效果的要求下，极大缩短液相分析时间的要求，具有超高的分离度。另外，百泰派克采用在线式自动化前处理与高分辨质谱仪联机使用，不但保证了实验数据的可靠性，而且提高了实验效率，充分保证前处理效果及鉴定结果可靠性。您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的样品寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，包括样品处理、酶切、质谱检测、原始数据分析等。

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