寡核苷酸分析

寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸 (DNA) 和核糖核酸 (RNA)，越来越多地用于诊断和治疗。例如，可以将DNA引入免疫细胞中，对它们进行基因改造，使其表达嵌合抗原受体蛋白，用于基于细胞的免疫治疗。各种 RNA ，包括信使 RNA (mRNA) 和小干扰 RNA (siRNA)，也分别用于蛋白质瞬时表达和干扰蛋白质表达，以用于治疗应用。随着寡核苷酸使用的增加，采用有效的方法来纯化、分析和表征寡核苷酸变得越来越重要。

寡核苷酸分析流程

一、寡核苷酸纯化方法

1.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) ：

SDS-PAGE是一种标准的纯度分析方法，可用于根据寡核苷酸的大小分离寡核苷酸。聚丙烯酰胺凝胶首先通过丙烯酰胺在交联剂存在下聚合形成，形成网状凝胶网络。然后施加电场，导致带负电的寡核苷酸向正极移动。根据寡核苷酸的大小，较小的分子比较大的分子更容易、更快速地穿过凝胶网络。经过设定的时间后，不同大小的寡核苷酸将在聚丙烯酰胺凝胶中迁移不同的距离，从而可以根据大小提取和纯化它们。

2.离子对反相高性能色谱 (IP-RP-HPLC) ：

IP-RP-HPLC是最流行的寡核苷酸纯化技术，在此技术中，添加低浓度的长链烷基胺，使其与 LC 流动相中的带负电荷的寡核苷酸结合。寡核苷酸在LC柱中的保留和洗脱受到寡核苷酸的电荷和离子对试剂（例如乙酸IP-RP-HPLC 的一个关键优势是它还可以直接与质谱仪耦合，以对寡核苷酸进行详细的质量表征。三乙铵）中的烷基链长度等因素的影响。例如，保留时间通常与离子配对试剂中寡核苷酸的电荷和长烷基链的疏水性成比例增加。

图1.离子对反相高效液相色谱（IP RP HPLC）寡核苷酸纯度分析

二、寡核苷酸的质量表征

分析寡核苷酸纯度的一种方法是使用质谱 (MS) 分析其质量。常见的方法之一是基质辅助激光解吸/电离飞行时间 (MALDI TOF) MS。该技术使用具有化学基质的激光来电离寡核苷酸样品，然后将离子加速通过飞行管到达检测器，检测器测量作为时间函数的粒子计数。 TOF 与分子的质量成正比。 MALDI TOF MS 具有高通量，非常适合分析 50 个碱基以下的寡核苷酸，因为电离效率和分离分辨率会降低。还存在光敏修饰寡核苷酸可能被强激光源损坏的风险。

三、寡核苷酸的结构表征

1.X射线晶体学

解析寡核苷酸结构的最有力方法是使用X射线晶体学，这与许多诺贝尔奖间接相关。 寡核苷酸结构。通过分析散射X射线，可以确定样品中的电子密度分布，从而重建内部分子排列。X射线的波长与分子中原子间键的尺寸相同，约为1.5埃，可以提供高度详细的

2.核磁共振 (NMR)

表征寡核苷酸结构的另一种流行方法是核磁共振 (NMR)。NMR 相对于 X 射线晶体学的优点是分子不必结晶。当处于强恒定磁场中的原子核受到弱振荡磁场的扰动时，它会通过发射具有原子核磁场频率特性的电磁信号来做出响应。当外部场的振荡频率与原子核的固有频率相匹配时，这种情况就会发生在共振频率处。因此，核磁共振谱提供了源自样品中不同原子核的特定共振特性的结构信息。根据实验的具体目标（例如分辨率），使用不同的 NMR 设置。