N末端测序：方法与应用

N末端测序是一种用于确定蛋白质或多肽的N末端（氨基末端）氨基酸序列的技术。这种技术在生物化学和分子生物学领域中很有用，尤其是当研究者想要确认蛋白质的起始位置或确定某种特定的蛋白质是否已经经过某种特定的修饰。

常用的N端测序方法主要有：

一、Edman 降解法：

Edman降解是一种非常成熟且经典的蛋白质和肽N端测序方法，广泛应用于生物技术领域。 Edman降解测序的原理主要是指通过循环反应从蛋白质的N端一一识别氨基酸类型，从而确定蛋白质的N端序列。异硫氰酸苯酯(PITC)在碱性条件下与待分析肽的N端氨基反应生成苯胺硫代甲酰胺衍生物，然后将偶联产物用酸处理。肽链的 N 末端被选择性裂解，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。提取的氨基酸衍生物在强酸性条件下转化为稳定的乙内酰脲硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），降解的PTH-氨基酸种类可以使用HPLC或电泳进行分析，以获得蛋白质或肽的N端序列信息。

图1. 用于多肽 N 末端测序的 Edman降解法

二、质谱法：

基于质谱的蛋白质N端序列测序技术可以一次同时测定蛋白质N端序列，特别是电喷雾电离（ESI）和基质辅助激光解吸/电离战斗时间（MALDI-TOF），质谱在蛋白质结构分析中的应用发生了革命性的飞跃。高灵敏度、高精度、高分辨率、高通量的生物质谱技术为蛋白质N端测序提供了重要选择。基于质谱的N端测序技术可以实现N端封闭和聚乙二醇化蛋白的序列测定，与Edman测序互补。该分析可用于确认和鉴定重组蛋白药物的高水平结构完整性以及重组蛋白N端序列的修饰位点。为此，N端序列测序可以为原抗体的序列比对和修饰奠定基础。

图2. 通过质谱法识别和测序 N 末端的工作流程

三、化学标记结合质谱分析

N端肽的许多研究方法采用质谱技术与多种化学方法和生物酶法相结合。例如，通过侧链氨基的还原、烷基化和胍基化来封闭蛋白质。游离的 N 末端用不同的生物素试剂标记。标记蛋白用胰蛋白酶消化后，通过亲和素亲和系统分离标记的N端肽，然后通过MALDI-TOF/MALDI-TOF-PSD MS从头测序，获得N端肽的序列。

图3. 化学标记/质谱工作流程

N端测序应用：

1.确定蛋白质或多肽的起始位置。

2.验证基因表达和翻译的准确性。

3.检测特定的蛋白质修饰，如乙酰化。

4.用于比较不同生物样品中蛋白质的异构体。