蛋白磷酸化测定

蛋白磷酸化是细胞内重要的信号转导机制，涉及许多细胞功能，如生长、分裂、死亡和应答等。磷酸化的蛋白在细胞信号转导中起着关键作用。因此，研究蛋白磷酸化对于理解细胞生物学和疾病进展是非常重要的。

图1. 酸化定量蛋白组学分析流程

蛋白磷酸化的测定通常使用以下几种方法：

1、放射性标记法：

通常使用γ-32P ATP作为放射性磷酸供体，经由蛋白激酶催化，使目标蛋白进行磷酸化。然后，通过放射性测定来检测蛋白磷酸化的水平。

2、Western blotting：

利用对特定磷酸化位点有特异性的抗体进行检测。首先，蛋白样品经过SDS-PAGE电泳分离，然后转移到PVDF或nitrocellulose膜上，之后用特异的磷酸化抗体进行检测。

图2. Far-Western Blot分析

3、质谱法：

通过蛋白或多肽的质谱分析，可以精确地确定蛋白磷酸化的位点和程度。常用的技术包括液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）。

4、Phos-tag凝胶电泳：

Phos-tag是一种能与磷酸化部位结合的化合物。在Phos-tag SDS-PAGE中，磷酸化的蛋白会在凝胶中移动变慢，从而与非磷酸化的蛋白分离。

5、ELISA（酶联免疫吸附测定法）：

利用磷酸化特异性抗体，可以构建ELISA实验来测定样品中磷酸化蛋白的水平。

6、流式细胞仪：

利用磷特异性抗体和荧光标记，可以通过流式细胞仪来分析单细胞水平上的蛋白磷酸化情况。

选择蛋白磷酸化测定的方法时，需要考虑样品的性质、所需的敏感度和分辨率、可用的仪器设备以及实验的预期目标。