2D-DIGE定量蛋白质组学

蛋白质组学是一门以蛋白质组为研究对象，旨在研究细胞、组织或生物体组成及其变化规律的学科。自从1975年O'Farrell和Klose等人建立双向凝胶电泳技术（2-DE）以来，2-DE技术凭借其高灵敏度和高分辨率、便于计算机进行图像分析处理、可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配等优点成为目前蛋白质组学研究的核心手段。

近年来，蛋白质组学的研究重点已从蛋白质的鉴定到量化转移。定量的蛋白质组学研究可定义为多个样品间蛋白质丰度相对差异的研究。尽管一些可选择的或互补的蛋白质组学技术正在发展，如同位素亲和标签和多维蛋白质鉴定技术，但双向电泳仍是当前仅有的可以同时分离大量的复杂的蛋白质混合物的关键技术。

传统的双向电泳2-DE在样品制备、电泳条件及凝胶染色等方面难以保证完全一致，因此容易产生胶间差异。这种差异会导致试验的重复性不佳，敏感度较低，甚至可能掩盖真实的生物学差异或产生误导性的假阳性结果。为了解决2-DE技术存在的缺陷，1997年Unlü et al提出了双向荧光差异凝胶电泳（Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，2D-DIGE）。

2D-DIGE 技术的原理是先用不同的荧光染料标记蛋白质样品，再使蛋白质变性，然后用固定pH梯度凝胶，根据蛋白质电荷差异分离出不同pH值的蛋白质带，再将此胶条置于含SDS 的聚丙烯酰胺凝胶上，根据蛋白质分子量加以分离，并通过多通道激光扫描分析不同蛋白质的SDS-PAGE凝胶图像。其主要步骤：用2种不同的荧光染料（Cy2、Cy3 或 Cy5）标记要比较的蛋白质样品；等量均匀混合荧光标记后的样品；使用相同的内标，将混合后的样品经双向凝胶电泳进行分离；在荧光显微镜下，用不同的激发波长来检测电泳结果。

图1. 2D-DIGE技术的一般流程

2D-DIGE相较于传统的2-DE具有的显著优势：

• 采用荧光标记技术，能同时比较多个样品，提高了实验效率和准确性。
• 由于荧光标记的引入，使得蛋白质的分离和检测更加精确，可以检测到更细微的蛋白质差异。
• 引入了内标，更好地消除了试验的偶然误差，避免了不同凝胶之间的差异，极大地提高了结果的准确性和可信度。
• 不需要进行电泳后的固定或脱色过程，减少了蛋白质特别是低分子量蛋白质的损失。
• 荧光信号的数字化处理使得数据的获取和分析更加快速和准确。

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