快来GET！蛋白分析常见问题与解答（二）

Q1.DIA质谱数据该如何分析得到某个特定的短肽峰图？

A:

DIA质谱数据的分析过程相对复杂，涉及多个步骤才能得到特定短肽的峰图。

一、数据预处理

1、原始数据格式转换：将质谱仪生成的原始数据（如.raw格式）转换为通用的mzML或mzXML格式，通常使用ProteoWizard等工具完成。

2、数据质量控制：检查转换后的数据文件，确保数据质量良好，没有出现大规模噪音或信号漂移。可以通过软件（如Thermo Xcalibur）初步观察数据，确认感兴趣的短肽是否存在。

二、谱库构建与使用

1、谱库构建：DIA数据的分析通常依赖于参考谱库。谱库可以通过DDA质谱或使用已有的公共谱库生成。谱库应包含感兴趣的短肽的碎片离子信息。

2、谱库匹配：使用专用软件（如Spectronaut、Skyline、DIA-NN等）将DIA数据中的碎片离子信息与谱库匹配，输出识别到的肽段列表及其定量信息。

三、特征提取

1、肽段识别：在谱库匹配过程中，软件根据碎片离子匹配度和保留时间等参数识别出肽段。精确的保留时间和质量误差窗口可以提高识别准确性。

2、肽段定量：识别出的肽段通过软件进行定量分析，通常基于峰面积的测量。此时可以将特定短肽提取出来进行进一步分析。

四、峰图生成

1、峰提取：对感兴趣的短肽，使用软件（如Skyline或Spectronaut）提取其在所有采集窗口中的信号强度。峰提取基于谱库匹配时确定的碎片离子的信号强度。

2、峰图生成：提取信号强度后，软件生成该短肽在保留时间上的峰图，显示其保留时间与信号强度的关系，通常呈现为高斯形峰。

五、数据质量评估

1、峰形评估：检查生成的峰图是否符合预期的单一高斯峰。如果出现多个峰或噪音过多，可能需要重新评估谱库匹配准确性或调整参数。

2、重复性检查：若数据来自多个生物学或技术重复，应检查该短肽在所有样本中的峰图，以确保重现性和一致性。

六、进一步分析与解读

1、相对定量：对该短肽在不同条件下的峰面积进行比较，得出其相对定量信息。

2、生物学意义解释：结合实验背景，分析特定短肽的定量变化是否具有生物学意义，如是否与蛋白质功能或实验处理相关。

Q2.同一个蛋白不同位置的短肽定量差异较大，这种现象正常吗？什么原因会造成这种现象呢？

A:

同一个蛋白不同位置的短肽定量差异较大是正常现象，可能由蛋白质结构、翻译后修饰、酶切效率、质谱检测灵敏度、样品制备误差、肽段的稳定性等多种因素共同导致。理解并尽可能控制这些变量，有助于提高实验的准确性和一致性。如果在实验中遇到这种情况，建议从这些方面逐一分析，找出可能的原因并加以优化。

一、蛋白质结构的影响

蛋白质的三维结构会导致某些区域的短肽更难以被酶切割或质谱检测到。例如，位于蛋白质内部的区域可能不易暴露在溶液中，导致切割效率低下，或者这些短肽在质谱分析中不易电离和检测到。

二、翻译后修饰（PTMs）

蛋白质的翻译后修饰，如磷酸化、乙酰化等，会影响短肽的性质和质谱响应。例如，修饰可能改变短肽的电荷或质量，从而影响其在质谱中的检测灵敏度。另外，某些修饰可能会阻碍酶的切割，导致这些区域的短肽产生不足或完全缺失。

三、酶切效率

不同氨基酸序列的酶切效率可能不同。某些氨基酸附近的序列或者结构环境可能影响酶的切割效率，导致某些短肽产生量较低或者切割不完全。这会直接影响定量结果的准确性。

四、质谱检测灵敏度

在质谱分析中，不同短肽的电离效率和质谱响应可能存在显著差异。某些短肽可能由于结构特性或修饰导致电离效率低，难以被质谱仪器准确检测到，从而影响定量的精确度。

五、样品制备误差

样品制备过程中的微小误差，如酶切不均匀、样品处理不一致、或样品损失，都可能导致不同短肽的定量出现差异；尤其是在高通量实验中，这种误差可能更为明显。

六、肽段的稳定性

在样品制备和分析过程中，一些肽段可能因为更容易降解而导致丰度低。例如，某些序列中包含易被酶切的位点或容易被氧化的氨基酸残基，可能会在制备过程中降解。

Q3.tmt标记定量蛋白质组学缺点中的比率压缩是怎么产生的，这个特点会有什么影响呢？为什么tmt只能进行相对定量，不能进行绝对定量？

A:

一、比率压缩的产生及其影响

在TMT标记定量蛋白质组学中，比率压缩是一个常见问题。比率压缩主要是由于在质谱分析过程中，多个不同的肽段同时离子化并进入质谱检测器，导致同一m/z值下的离子信号被多个不同肽段的同位素标签共享。因为TMT标签的离子丰度在不同样品间会略有不同，而这些微小的差异在混合分析时往往被平均或削弱，最终导致TMT标签之间的信号比值被压缩。

比率压缩的结果是，样品间的差异被低估，特别是在那些实际差异较大的样品之间，信号的比例可能会被压缩到接近1:1。这种现象不仅影响了实验的精确度，还可能掩盖了生物学上有意义的变化，导致对蛋白质表达水平的误判。

为了解决这个问题，研究者们通常会使用一些校正方法，例如：比率压缩校正算法、基于标准化蛋白质的校正方法等，以减小比率压缩对定量结果的影响。

二、TMT只能进行相对定量，不能进行绝对定量的原因

TMT是一种同位素标记方法，通过在肽段上标记不同的同位素标签，实现多重样品的相对定量。它的工作原理依赖于不同样品之间标记肽段信号强度的比较，而不是测量某个肽段或蛋白质的绝对丰度。

• 缺乏内标：TMT标记定量通常没有绝对定量的内标或校准曲线，不能直接测量蛋白质的绝对丰度。
• 仪器响应不一致性：不同蛋白质或肽段的质谱响应因子（即质谱仪对不同肽段的响应强度）可能存在差异，这种差异性使得无法直接推断出蛋白质的绝对含量。

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