蛋白分析常见问题与解答（三）

Q1.细胞体内交联和先裂解再交联有什么区别？

A:

交联(cross-linking)法通过化学反应将两个或两个以上的分子链接在一起，这种技术常常被用于固定细胞内的分子在某一时刻的相对位置，帮助研究者更好地理解细胞内的生物过程，也是蛋白质相互作用研究中的重要技术。交联试剂可以在蛋白质相互作用时将它们共价交联在一起，捕获蛋白质-蛋白质复合物，冻结短暂微弱的相互作用，从而实现对短暂相互作用蛋白的分离和表征。

一般来说，交联过程在体内或体外都可以进行，使用体内还是体外交联取决于项目的需求。两者区别在于，蛋白质在体内交联过程中以天然状态交联，而对于体外交联，蛋白质可能会发生变性。

1.细胞体内交联：

体内交联反应的过程中，蛋白质交联反应发生在细胞内部，因此可以消除假阳性的相互作用及蛋白质复合物稳定性丧失的风险。位于细胞膜内的蛋白质通常使用疏水性和脂溶性交联剂进行交联反应，而位于细胞膜上的蛋白质（如血浆锚定的受体）通常使用亲水性和水溶性交联剂进行交联反应。尽管蛋白质保持天然状态，但由于细胞中蛋白质的复杂性，体内交联的优化过程也可能很复杂，仍然存在发生非特异性交联反应的可能性，可以通过使用间隔臂较短的交联剂来消除非特异性交联的问题。

2.先裂解再交联：

在体外交联过程中，细胞被均质化，裂解。因此，该方法更适合分析较稳定的蛋白质-蛋白质相互作用。由于在特定的裂解缓冲液中对细胞进行裂解，想要对反应条件进行控制变得比较容易，如温度、pH、离子强度等反应条件都可以进行调整。因为不在受到体内环境的限制，也有更多类型的交联剂可供选择，也可以更好的控制非特异性交联。

选择哪种方法取决于你的研究目标。如果你希望捕获活细胞中的蛋白质互作，那么建议你选择体内交联。而如果你更关心在裂解液中的蛋白质互作，那么你可以选择先裂解再交联。

Q2.想要二维凝胶电泳的流程图

A:

我们可以提供二维凝胶电泳的主要流程供您参考：

1.样品准备：

首先收集和准备需要进行电泳的蛋白质样品。

2.第一维：等电聚焦（IEF）：

在第一维电泳中，利用蛋白质在一定pH范围内的等电点（pI，即蛋白质不带电的pH值），使蛋白质在电场中沿pH梯度运动，从而实现分离。将样品加载到一根填充有等电聚焦胶的管子（IPG条）中，然后在电场下进行运行。样品中的蛋白质会就在它们的等电点处聚集。

3.第二维：SDS-PAGE：

第二维电泳是一种标准的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），其使用SDS（十二烷基硫酸钠）来使蛋白质带有负电荷。在此步骤中，IPG条被放在SDS-PAGE凝胶上，然后在电场的作用下，不同大小的蛋白质会在凝胶中以不同的速度迁移从而实现二维分离。

4.染色和成像：

电泳完成后使用染料（如考马斯亮蓝或银染）对凝胶进行染色。然后使用适当的成像设备对染色的凝胶进行成像，这样就可以观察到一个由不同蛋白质斑点组成的凝胶图像。

5.图像分析：

最后，通过与已知的标准或者对照进行比较，分析成像结果以确定各个蛋白质斑点的等电点和分子量。也可以进一步对特定的蛋白质斑点进行切割、提取和质谱分析，以确定其蛋白质身份。

Q3.亚硝基化修饰位点打不出来是什么原因呢？

A:

亚硝基化修饰位点打质谱打不出来，可能是由于以下几个原因：

1.样品制备问题：

如果你在进行样品的制备过程中出现了错误，或者样品的保存和处理不当，可能会导致亚硝基化修饰蛋白的丢失或降解。

2.方法选择问题：

亚硝基化修饰的位点鉴定需要专门的数据库和软件支持，如果没有使用合适的工具，可能会导致鉴定出错。

3.质谱参数设置问题：

如果质谱参数设置不合适，例如碎片电压太高，可能会导致亚硝基化修饰位点的信息丢失。

4.蛋白表达量或修饰程度问题：

如果目标蛋白的表达量过低，或者亚硝基化修饰的程度不足，都可能影响到你检测这些位点。

以上都是可能的原因，具体哪个原因导致的问题，需要结合实验具体情况去判断，然后对症下药。

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