生物制品表征常见问题与解答（四）

Q1.elastase可以单独用做肽图吗？chymotrypsin是单独一管做肽图还是和trypsin一起呢？

A:

Elastase通常不单独用于肽图分析，因为它的切割特异性不如trypsin等其它酶。Elastase主要切割丝氨酸和甘氨酸旁边的肽键，这可能会产生非常短的肽段，不利于后续的肽段鉴定。但在某些特定情况下，弹性蛋白酶可以作为一种选择，尤其是当研究的蛋白质样品中主要含有弹性蛋白或者弹性蛋白相关的蛋白质时。

Chymotrypsin可以单独使用进行肽图分析，尤其是在研究含有大量芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等）的蛋白质时。同时，它也可以和Trypsin联合使用。Chymotrypsin和Trypsin具有不同的特异性，分别对不同类型的氨基酸具有高度的特异性。Trypsin主要在精氨酸和赖氨酸的C端酶解，而Chymotrypsin则在芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸）的C端酶解。因此，它们的联合使用可以提高肽段的覆盖率和鉴定的复杂度，这种方法在处理结构复杂或者高度疏水性的蛋白时较为常见。

Q2.基于SEC的分子大小变异分析用的什么色谱柱？

A:

基于SEC的分子大小变异分析使用的是尺寸排阻色谱柱（Size Exclusion Chromatography，SEC），也称为凝胶渗透色谱柱（Gel Permeation Chromatography，GPC）。这种色谱柱通常填充了交联度高的多孔聚合物材料，根据填充物的不同具体可分为以下几个类型：

1.硅胶基质的色谱柱：

• 如Bio-Rad的Bio-Sil SEC柱。
• 这些柱子有不同的孔径，适用于不同大小范围的分子分离。
   

2.聚合物基质的色谱柱：

• 如TSKgel G3000SWxl（Tosoh Bioscience）。
• 这些柱子特别适用于生物大分子如蛋白质、核酸等的分离。
   

3.超高效体积排阻色谱（UHPLC SEC）柱：

• 如Waters的ACQUITY UPLC BEH SEC柱。
• 这些柱子能提供更高的分辨率和更快的分离速度，适合于更复杂样品的分析。

Q3.透射电镜检测拍的背景有很多黑色团状的物质，看着像把颗粒都裹进去了，请问可能是什么原因？

A:

透射电镜（TEM）检测中出现大量黑色团状物质，可能有多种原因。以下是一些常见的原因可供您参考：

1. 样品制备问题

• 染色剂残留：在样品染色过程中，染色剂可能没有完全洗净，导致染色剂残留在背景中形成黑色团状物。
• 样品干燥不完全：样品在干燥过程中，如果没有完全干燥，可能会导致一些溶剂残留，形成黑色团块。
• 固定剂问题：样品固定过程中，固定剂可能没有均匀分布或没有充分渗透，导致固定剂残留。

2. 样品污染

• 外部污染：样品在制备或转移过程中可能受到外部污染，例如灰尘、纤维等物质。
• 仪器污染：透射电镜的样品台或其他部件可能存在污染，影响成像质量。

3. 样品自身特性

• 聚集现象：样品本身可能存在自发聚集现象，形成团状物。
• 降解产物：样品在制备过程中可能发生降解，形成一些不溶性产物。

4. 成像参数问题

• 电子束损伤：过强的电子束可能会导致样品损伤或炭化，形成黑色团状物。
• 成像条件：成像过程中，电压、电流等参数设置不当可能导致成像质量下降，出现伪影。

建议的解决方案：

1. 优化样品制备过程

• 确保染色剂和固定剂的使用量和清洗步骤充分。
• 确保样品完全干燥，避免残留溶剂。

2. 避免污染

• 在无尘环境中进行样品制备和转移。
• 定期清洁透射电镜的样品台和其他部件，避免仪器污染。

3. 调整成像参数

• 适当调整电子束的强度，避免对样品的损伤。
• 根据样品的特性，优化成像的电压和电流参数。

请注意，具体的处理方法还需要根据你的样品性质和实验目的来定。在解决问题的过程中，可能需要多次尝试和优化。

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