多组学整合分析常见问题与解答（五）

Q1.请教RNA-seq数据标准化问题？

A:

RNA-seq数据标准化是在数据分析过程中的一个重要步骤，目的是消除测序深度、基因长度、样本间差异等因素对数据的影响，以便更准确地比较不同样本的基因表达水平。

以下是几种常见的RNA-seq数据标准化方法：

1.RPKM/FPKM（Reads/Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）：

这是一种最早的RNA-seq数据标准化方法，它考虑了基因长度和测序深度的影响。然而，这种方法的一个主要缺点是它假设所有基因的表达量都是相同的，这在实际情况中通常不成立。

2.TPM（Transcripts Per Million）：

与RPKM/FPKM类似，TPM也考虑了基因长度和测序深度的影响，但它的计算方式使得所有样本的TPM值之和都是相同的，因此更适合比较不同样本的基因表达量。

3.DESeq/edgeR的标准化方法：

这些基于负二项分布模型的差异表达分析软件包，都提供了自己的标准化方法，如DESeq的median of ratios方法和edgeR的TMM（Trimmed Mean of M-values）方法。这些方法的主要思想是找到一些不变的基因，然后用这些基因来估计因子，以消除样本间的技术偏差。

在选择标准化方法时，需要考虑数据特性和你的研究目标。一般来说，如果研究目标是寻找差异表达基因，那么使用DESeq或edgeR的标准化方法可能是一个更好的选择。

Q2.如何完成RNA-seq的分析流程？

A:

RNA-seq（RNA测序）是一种使用高通量测序技术来研究整个细胞转录组（包括mRNA，ncRNA等）的方法。它可以用来研究在特定时间点和/或条件下，哪些基因被表达以及表达的程度。

以下是一个常规的RNA-seq分析的基本步骤，这个流程可能会根据具体的实验设计和分析目标有所不同：

1.样品准备：

从待研究的生物样品中提取总RNA。为保证分析结果的准确性，需确保RNA的纯度和完整性。

2.建立cDNA文库：

对提取的RNA进行逆转录，生成cDNA。可选择建立有或无寡糖核苷酸标签（polyA-tail）的文库。对于无polyA-tail的RNA（如rRNA、tRNA等），可采用特殊的文库构建方法。

3.高通量测序：

使用高通量测序平台（如Illumina、Ion Torrent等）对cDNA文库进行测序。通常生成成千上万的短序列读取（reads）。

4.质量控制：

对测序得到的原始数据（raw data）进行质量评估和过滤，如去除低质量读取、接头去除等。

5.比对到参考基因组：

将质控后的读取与已知的参考基因组进行比对，常用的比对软件包括HISAT2、STAR、Bowtie2等。比对结果通常以SAM或BAM格式保存。

6.计算基因表达量：

根据比对结果，统计各基因或转录本的表达量。常用的表达量单位包括FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）、TPM（Transcripts Per Million）等。

7.差异表达分析：

对不同样品或处理组之间的基因表达量进行差异分析，识别显著差异表达的基因。常用的差异分析软件包括DESeq2、edgeR、limma等。

8.功能注释与富集分析：

对差异表达基因进行功能注释，如基因本体（Gene Ontology, GO）注释、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路注释等。同时，进行富集分析，以揭示差异表达基因在生物过程、分子功能、细胞组分等方面的特征。

9.结果可视化：

将分析结果可视化，如热图、火山图、MA图等。这有助于更直观地展示数据和解释实验结果。

10.验证与解释：

根据RNA-seq分析结果，可选择部分差异表达基因进行实验验证，如qRT-PCR、Western blot等。结合实验背景和已知知识，对分析结果进行解释和探讨。

需要注意的是，实际分析过程中可能会遇到各种问题，如样品质量、测序深度、数据分析方法等。因此，在实际操作中，需要根据项目需求和实验条件进行具体优化和调整。在数据分析过程中，可以利用多种软件和数据库，结合生物信息学方法对结果进行深入挖掘。

Q3.RNA 测序技术的应用场景有什么？

A:

RNA测序（RNA-seq）是一种应用广泛的技术，可以用于许多生物学和医学研究的领域。以下是一些常见的RNA-seq的应用场景：

1.基因表达分析：

RNA-seq可以用于测量不同样本或条件下基因的表达量，从而可以研究基因的表达调控机制，或者找出在特定条件下表达量变化的基因。

2.差异表达基因分析：

通过比较不同组别（例如正常组和疾病组，处理组和对照组）的基因表达模式，可以找出差异表达的基因，这些基因可能在疾病发生，发展，治疗等过程中起重要作用。

3.新基因发现：

RNA-seq可以用于发现新的转录本，新的剪接形式，新的基因，以及新的非编码RNA。

4.可变剪接分析：

RNA-seq可以用于研究可变剪接，这是一种调控基因表达的重要机制，可以产生多种不同的蛋白质异构体。

5.生物标志物发现：

在疾病研究中，RNA-seq可以用于寻找潜在的生物标志物，这些标志物可以用于疾病的早期诊断，预后评估，治疗效果评价等。

6.非编码RNA研究：

RNA-seq可以用于研究非编码RNA（如miRNA，lncRNA等），这些RNA虽然不编码蛋白质，但是在基因调控，发育，疾病等过程中起重要作用。

7.基因功能研究：

通过对基因敲除，敲低，过表达等样本的RNA-seq分析，可以推测基因的功能。

8.种群遗传学和进化生物学：

RNA-seq可以用于研究种群的遗传多样性，基因的选择压力，物种的进化关系等。

这些只是RNA-seq的部分应用，实际上，随着技术的进步，RNA-seq的应用领域还在不断扩大。

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