单细胞分析常见问题与解答（五）

Q1.生命科学单细胞测序（10×genomics技术）的原理是什么？

A:

10x Genomics技术是一种革命性的单细胞测序方法，它可以在单细胞分辨率水平上获取基因组、转录组和表观组数据。这种技术的原理包括以下几个关键步骤：

1.单细胞悬浮液制备：

首先，将组织或细胞样本制备成单细胞悬浮液。这通常通过机械或酶处理来实现。

2.微滴封装：

将单细胞悬浮液与一种特殊的凝胶珠混合，这些凝胶珠上带有独特的分子标签（barcodes）。利用微流体技术，将单个细胞与一个凝胶珠一起封装到微滴中。在理想情况下，每个微滴只包含一个细胞和一个凝胶珠。

3.mRNA捕获和条形码标记：

细胞在微滴中破裂，释放出mRNA。mRNA分子与凝胶珠上的寡核苷酸探针结合，这些探针带有聚A尾（poly-A tail），可以与mRNA的3'端（带有poly-A尾的端）结合。通过这种结合，mRNA被带有细胞特异性条形码和UMI（独特分子标识符）的探针捕获。UMI有助于消除PCR扩增过程中的偏差，并允许更准确地估计原始mRNA分子的数量。

4.逆转录和扩增：

捕获的mRNA被逆转录成cDNA，并在微滴中进行PCR扩增。此过程中，细胞特异性条形码和UMI被保留，并扩增到每个cDNA分子上。

5.cDNA文库制备：

将扩增的cDNA从微滴中收集，建立一个测序文库。这个文库包含了带有细胞特异性条形码和UMI的cDNA分子。

6.高通量测序：

利用高通量测序平台（如Illumina）对cDNA文库进行测序。测序数据可以用于后续的分析，如基因表达水平、异质性和细胞亚群的鉴定等。

7.数据分析：

对测序数据进行处理和分析，将读取（reads）分配给不同的细胞，并根据UMI计算基因表达量。

此外，可以使用这些数据进行进一步的生物信息学分析，例如聚类细胞、寻找差异表达基因和细胞间相互作用的研究。

Q2.如何看待单细胞测序及转录组测序的可重复性和指导意义？

A:

单细胞测序和转录组测序在生物学研究中具有重要价值，它们为我们提供了关于细胞和组织的详细信息。然而，在评价这些技术的可重复性和指导意义时，我们需要关注几个方面：

1.可重复性：

单细胞测序和转录组测序需要一定的技术成熟度和严格的实验操作来确保结果的可重复性。实验设计、样品制备、测序平台和数据处理流程等各个环节都可能影响实验结果的可重复性。为了确保可重复性，研究者需要关注这些实验流程，并进行严格的质量控制。

2.生物学背景：

为了充分发挥单细胞测序和转录组测序的指导意义，研究者需要充分了解所研究的生物系统和问题背景。这些技术提供的信息是关于基因表达和调控的，因此研究者需要具备相关领域的知识来解释数据和得出结论。

3.数据解析和解释：

数据分析和解释是单细胞测序和转录组测序中的关键步骤。选择合适的分析方法和正确解释结果对于实验结果的指导意义至关重要。为了确保数据分析的可靠性，研究者需要使用已经验证的分析工具和流程，并根据具体研究问题调整参数。

4.整合其他数据类型：

单细胞测序和转录组测序提供了基因表达的信息，但往往需要与其他数据类型（如基因组、表观组和蛋白质组数据）结合起来，以更全面地理解生物过程。通过整合不同类型的数据，研究者可以更好地理解基因调控和功能，从而提高研究的指导意义。

单细胞测序和转录组测序在生物学研究中具有重要的指导意义。然而，为了确保这些技术的可重复性和指导意义，研究者需要关注实验设计、数据处理和生物学背景等方面。通过严谨的实验操作和合理的数据解释，这些技术可以为我们提供关于生物系统的宝贵信息。

Q3.单细胞质谱流式技术分析：体积和尺寸怎么测量，什么原理？

A:

单细胞质谱流式技术（single-cell mass cytometry，简称 CyTOF） 结合了流式细胞仪和质谱技术，主要是用于分析细胞表面和细胞内的分子， 流式细胞仪（Flow Cytometry）可以实现细胞的体积和尺寸测量，其通过激光或其他光源来检测流经流道的单个细胞，并可以测量不同的物理和化学特性，细胞体积和尺寸的测量主要基于以下原理：

1.前向散射（Forward Scatter，FSC）:

FSC与细胞的大小有关。当流式细胞仪中的激光束照射到细胞时，细胞会将一部分激光散射在前方。大的细胞会散射更多的光，因此FSC通常用来估算细胞的大小。

2.侧向散射（Side Scatter，SSC）: 

SSC与细胞的复杂性或颗粒度有关。激光束照射到细胞后，细胞内的颗粒会将光散射到侧面。SSC可以用来估算细胞的颗粒度或内部结构的复杂性。

3.染料测量:

有些流式细胞术可以通过染料来测量细胞的体积。这些染料可以与细胞质有选择性地结合，并且结合的量与细胞体积成正比。通过测量荧光强度，可以估算细胞的体积。

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