单细胞分析常见问题与解答（七）

Q1.申请了单细胞测序数据，每个样本的fastq数据都有L001-L004四个fastq数据，该如何处理？

A:

单细胞测序数据通常包括单细胞RNA测序（scRNA-seq）、单细胞DNA测序（scDNA-seq）、单细胞ATAC测序（scATAC-seq）等。不同类型的单细胞测序有不同的下游分析流程。在进行单细胞测序数据的处理时，如果每个样本的FASTQ数据包含了L001、L002、L003、L004四个文件，这通常是由于测序平台（如Illumina）采用了配对末端（paired-end）测序的策略并且每个样本可能涉及多个lane（测序通道）。以下是对这种情况的处理步骤：

 一、理解文件命名规则

1、L001-L004：表示不同的测序lane，通常Illumina平台在不同的lane上进行并行测序。

2、每个样本可能会有多个lane的输出数据，且每个lane的FASTQ文件会分为两个文件对：一个是R1（forward read），另一个是R2（reverse read），这两个文件分别对应配对末端测序的两部分。

3、通常L001、L002、L003、L004分别代表不同的测序lane，这意味着每个样本可能会产生4个文件，分别为：

（1）L001_R1.fastq 和 L001_R2.fastq

（2）L002_R1.fastq 和 L002_R2.fastq

（3）L003_R1.fastq 和 L003_R2.fastq

（4）L004_R1.fastq 和 L004_R2.fastq

 二、通用流程

1. 合并 L001-L004 数据：如果你的样本是来自多个lane（比如L001到L004）而你希望对每个样本的测序数据进行统一的分析，通常的做法是将每个lane的R1和R2文件合并为一个大的文件对；可以使用工具如 cat（在Linux系统下）来合并这些文件。

2. 质量控制（QC）：在合并多个lane的数据后，进行质量控制（QC）是一个重要步骤。你可以使用 FastQC 来检查FASTQ文件的质量，确保测序数据的质量在每个lane中没有重大差异。FastQC会为每个lane生成质量报告，如果发现某些lane存在显著的问题，可以选择去除该lane的数据或进行其他处理。

3. 去除低质量序列（可选）：如果FastQC报告显示存在低质量的序列（例如，读长过短或错误率过高），可以使用如 Trimmomatic、Cutadapt 等工具进行修剪和去除低质量的序列。

4. 去除适配子序列：单细胞测序数据通常会有接头序列（adapter sequences），特别是在短的读长测序中，使用工具如 Cutadapt 或 TrimGalore 可以去除这些接头序列；去除适配子是常见的预处理步骤，尤其在使用特定的引物时。

5. 比对：使用适合数据类型的比对工具（例如STAR、bwa）。

6. 定量：生成表达或变异矩阵。

7. 下游分析：根据数据类型使用合适的生物信息学工具进行分析。

三、根据数据类型进行后续分析

1. 单细胞RNA测序（scRNA-seq）

（1）常用工具：CellRanger（10x Genomics平台数据）、Seurat（R包）、Scanpy（Python包）

（2）流程概述：

• 使用CellRanger进行质控、比对和定量，生成基因表达矩阵（Gene Expression Matrix）。

• 使用Seurat或Scanpy进行降维、聚类和细胞类型注释。

2. 单细胞DNA测序（scDNA-seq）

（1）常用工具：CellRanger-DNA、GATK、CNVkit

（2）流程概述：

• 使用CellRanger-DNA进行质控、比对和变异检测。

• 进行单细胞拷贝数变异（CNV）分析和体细胞突变检测。

3. 单细胞ATAC测序（scATAC-seq）

（1）常用工具：CellRanger-ATAC、ArchR、Signac

（2）流程概述：

• 使用CellRanger-ATAC进行质控和比对，生成可及性峰值矩阵。

• 使用ArchR或Signac进行下游可及性模式分析。

Q2.单细胞测序的时候，可以先将组织做原代细胞培养，等细胞培养到一定量以后再送检吗？

A:

在单细胞测序实验中，直接从原始组织分离细胞通常是最佳选择，而不是通过原代细胞培养后再送检。这主要是因为细胞培养可能引起以下问题，影响单细胞测序结果的准确性和可靠性：

• 培养可能导致细胞异质性丢失。

• 培养条件改变细胞的基因表达谱。

• 增加污染风险和背景噪声。

推荐的处理方式：

1、优先选择直接从组织分离单细胞

（1）通过酶消化或机械分离获得单细胞悬液。

（2）立即进行测序，避免细胞状态改变。

2、特殊情况下可短时间培养

（1）若必须培养，时间控制在24-48小时内，严格优化培养条件。

（2）采集培养前后样本对比，评估基因表达差异。

Q3.单细胞测序对研究基因表达、转录调控等方面有什么帮助？

A:

单细胞测序技术在基因表达、转录调控及相关领域提供了强大的研究工具，其优势主要体现在解析细胞异质性、揭示基因调控机制以及推动生物医学领域的发展上。

1、揭示细胞异质性

（1）精准区分细胞亚群，解析组织中的功能差异。

（2）追踪发育、分化及应激反应中的动态变化。

2、构建高分辨率基因表达图谱

（1）明确细胞类型的特征基因表达。

（2）发现新的细胞类型和功能群。

3、研究转录调控网络

（1）鉴定转录因子与靶基因关系。

（2）构建基因共表达网络，解析调控模块。

4、重建细胞发育轨迹

（1）利用伪时间分析揭示分化路径。

（2）识别发育或疾病过程中的关键节点。

5、多组学整合

（1）结合转录组、表观组、蛋白质组，全面解析基因调控。

（2）空间转录组揭示基因表达的组织分布。

6、推动精准医学

（1）识别稀有细胞群，优化诊断与治疗。

（2）追踪疾病进程及治疗响应。

7、解析细胞间通讯

（1）通过配体-受体分析揭示细胞互作网络。

（2）应用于肿瘤微环境研究。

8、研究稀有细胞功能

揭示发育或疾病中的关键稀有细胞作用。

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