单细胞分析常见问题与解答（十一）

Q1.用G&T-seq方法对单细胞基因组和转录组进行分离与平行测序的具体步骤？

A:

G&T-seq（Genome and Transcriptome sequencing）方法是一种同时获取单细胞基因组（gDNA）和转录组（mRNA）信息的技术。以下是G&T-seq方法对单细胞基因组和转录组进行分离的具体步骤：

1.单细胞分离：

首先，使用流式细胞术、激光捕获显微切割或微管吸吮等方法将单个细胞分离到PCR管或微孔板中。

2.溶细胞与RNA捕获：

加入含有核糖核酸酶抑制剂的溶细胞液，将细胞轻轻破碎。随后加入寡（dT）磁珠，通过mRNA上的poly(A)尾与寡（dT）磁珠的互补结合，实现mRNA的捕获和分离。

3.洗脱与基因组DNA收集：

在完成mRNA的捕获和分离后，将寡（dT）磁珠从反应液中移除。此时，剩余的细胞溶液中含有基因组DNA。将基因组DNA收集，以便后续的建库和测序。

通过以上步骤，G&T-seq方法实现了单细胞基因组和转录组的分离。接下来，可以针对收集到的mRNA和基因组DNA进行逆转录、建库、测序和数据分析等操作，从而在单细胞水平上研究基因组变异与转录活动之间的关系。

G&T-seq方法对单细胞基因组（gDNA）和转录组（mRNA）进行平行测序的主要步骤如下：

1.mRNA逆转录：

将分离得到的mRNA进行逆转录，生成cDNA。可以使用带有寡（dT）引物的逆转录酶进行此步骤。同时，添加特定的引物序列，以便后续建库和测序。

2.建立转录组测序库：

对生成的cDNA进行建库。这通常包括末端修复、接头连接（包含index/barcode以区分不同样本）、选择性扩增等步骤。建好的转录组测序库用于后续的高通量测序。

3.建立基因组测序库：

将收集到的基因组DNA进行建库。这包括DNA断裂、末端修复、接头连接（同样包含index/barcode，以区分不同样本）和PCR扩增等步骤。建好的基因组测序库将用于后续的高通量测序。

4.混合基因组和转录组测序库：

将建好的基因组和转录组测序库按照一定比例混合。由于每个测序库中都包含独特的index/barcode，可以在数据分析阶段将它们区分开。

5.高通量测序：

将混合好的测序库进行高通量测序，如Illumina测序平台。测序过程中，基因组和转录组数据将同时生成。

6.数据分离与分析：

根据测序数据中的index/barcode，将基因组和转录组数据区分开。接下来，对这两部分数据进行相应的分析，包括基因组变异检测、基因表达量估计、差异表达分析等。

通过G&T-seq方法进行单细胞基因组和转录组的平行测序，研究者可以在单细胞水平上同时获得基因组变异和转录活动的信息。这对于研究表型与基因型之间的关联、解析异质性细胞群体中的细胞状态以及探讨基因调控机制等方面具有重要价值。

Q2.质谱流式实验技术流程中样本染色的最后一步细胞浓度调整需要计数实现吗？补充beads的目的是什么？

A:

是的，样本染色完成后，通常需要通过计数来调整细胞浓度。细胞浓度的准确计算对于流式实验非常重要，特别是当细胞在实验过程中会被分拣或收集时。这样，你才能准确地量化每个样本中细胞的数量，从而在后续数据分析中进行标准化或归一化。

在质谱流式实验中，beads（通常是有特定金属标记的微球）有多个用途：

1.校准:

使用已知大小和荧光强度的beads来校准流式仪器。

2.计数:

在样品中加入已知数量的beads可以作为内部标准，帮助准确计算样品中的细胞数量。

3.质量控制:

确保流式仪器的性能稳定。

4.解决细胞聚集: 

在某些情况下，beads也可以作为物理分隔剂，减少细胞之间的聚集。

Q3.做单细胞测序，请问每个分组需要送几个样?

A:

在百泰派克，我们致力于为客户提供科学严谨的实验支持和高质量数据分析。关于单细胞测序，每个分组的送样数量建议如下：

1.生物学重复：

为了确保实验结果具有统计学意义和可重复性，每组建议提供 3-5个生物学重复。更多重复可提升数据的可靠性和研究结论的可信度。

2.样本特性：

如果样本具有高度异质性（如肿瘤或复杂组织），建议增加送样数量，以全面捕捉单细胞水平的多样性。

3.实验目标和预算：

若为探索性实验，每组3个样本可满足基本需求；若为深入研究或高水平发表，建议每组送5个或更多样本以提升分析精度。

若需进一步了解单细胞测序的样品要求及最佳送样策略，请随时联系百泰派克的技术支持团队。我们提供从实验设计到数据分析的一站式服务，欢迎随时咨询！

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