多组学整合分析常见问题与解答（十五）

Q1. 关于转录组测序双端测序的问题，转录组测序时，pair end 双端测序时，用FPKM计算为什么小于等于RPKM的2倍？

A:

RPKM（Reads Per Kilobase of transcript, per Million mapped reads）和FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript, per Million mapped reads）都是转录组数据分析中用于标准化基因表达水平的度量单位。它们考虑了每个基因的长度和测序深度，以便在不同的样本之间进行比较。

1.RPKM 是用于单端测序数据的标准化方法。它考虑了基因长度和总的测序读段数，以便在不同样本间进行公平比较。

2.FPKM 通常用于双端测序，考虑的是“片段”而不是“读段”。在双端测序中，一对读段被认为是一个“片段”，即使它们是从同一DNA片段的两端测得的。

尽管这两种方法在技术上有所不同，但它们在数学上是等价的，因为它们都是通过考虑基因长度和总测序读段（或片段）数来标准化基因表达的。因此，在单端测序的情况下，RPKM的值将等于FPKM的值，因为每个读段都被视为一个独立的单位。

在双端测序的情况下，每对读段被视为一个“片段”，因此理论上，如果每个片段产生一对读段，你可能预期FPKM值会是RPKM值的两倍。然而，FPKM值小于或等于RPKM值的两倍的原因包括：

1.片段计数：

在FPKM的计算中，一对读段（即一个片段）无论是否完全比对到参考基因组，都只计为一个片段，而不是两个独立的读段。

2.读段比对的复杂性：

并非所有读段都能成功比对到参考基因组，有些可能因为质量问题或其它原因（如序列多样性、测序错误等）而未被计入。

因此，FPKM值不一定是RPKM值的两倍，而是取决于成功比对的片段数和这些片段如何分布于特定基因的长度。在处理高质量的、成功比对的双端读段时，FPKM值通常会接近RPKM值的两倍，但不会超过，因为它们都是对相同基础数据的标准化表示。

Q2. 转录组测序中，三组数据两两进行比较应该怎么绘制热图?

A:

在转录组测序中，如果你有三组数据并想进行两两比较，可以参考以下步骤：

1.数据预处理：

• 首先，对原始的转录组测序数据进行质控和过滤，去除低质量的reads和可能的污染。

• 然后，使用合适的对齐和拼接工具将测序数据比对到参考基因组上，得到每个基因的表达水平。

• 最后，对表达矩阵进行归一化处理，例如使用TPM（每百万转录本数）或FPKM（每千万转录本数）来调整样本之间的表达量差异。

2.差异分析：

• 对于三组数据两两进行比较，可以使用合适的差异分析方法，例如DESeq2、edgeR或limma等，来鉴定差异表达基因。

• 这些方法会计算每个基因在不同组之间的差异表达水平，并给出统计学上的显著性。

• 一般会选择一定的差异表达阈值和显著性水平，以筛选出具有生物学意义的差异表达基因。

3.热图绘制：

• 在差异分析得到差异表达基因列表后，可以使用热图来可视化这些基因在不同样本之间的表达模式。

• 一种常用的方法是使用基因表达水平的Z-score进行归一化，将每个基因在不同样本中的表达量转化为标准差单位。

• 然后，根据Z-score的值，使用颜色编码来表示基因的表达水平，例如使用红色表示高表达，蓝色表示低表达。

• 可以使用专业的数据可视化软件，如R中的pheatmap包或Python中的seaborn包来绘制热图。

• 在热图中，每一行代表一个基因，每一列代表一个样本，颜色的深浅表示基因在不同样本中的表达量。

4.热图解读：

• 通过观察热图，可以直观地了解不同样本之间的基因表达模式。

• 可以根据颜色的深浅来判断基因在不同样本中的表达量高低，以及是否存在差异表达。

• 可以根据热图中的聚类模式，判断基因在不同样本中的表达模式是否有相似性或差异性。

• 可以进一步分析热图中的热点区域，即差异表达基因的集中区域，来寻找具有生物学意义的基因集合。

Q3. 转录组测序，不同物种中的某些特定基因的基因表达量该怎么计算？

A:

计算不同物种中特定基因的表达水平，可以参考以下方法：

1.质量控制和数据清理:

• 使用质量控制工具（例如FastQC）对原始测序数据（FASTQ文件）进行评估，以检查测序质量，重复内容，接头污染等。

• 基于质量控制报告，用序列清理工具（例如Trimmomatic或cutadapt）去除低质量序列，接头等。

2.读段比对:

• 选择一个合适的参考基因组和/或转录组，并下载相应的序列和注释文件。对于不同物种，你需要各自物种的参考序列。

• 使用比对工具（例如HISAT2、STAR或Bowtie2）将清理后的读段（reads）比对到参考基因组上。这一步会产生SAM或BAM格式的文件，其中包含了读段与参考基因组的比对信息。

3.计数:

• 使用特定于转录组的工具（如HTSeq或featureCounts）从比对文件中提取基因表达计数数据。这些工具会根据读段比对到参考基因组的哪些基因来计算每个基因的读段计数（即每个基因的覆盖读段数）。

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