蛋白分析常见问题与解答（十一）

Q1.请问怎么找细胞系的生物标志物呢？例如：HK-2

A:

找细胞系的生物标志物（生物标记物）通常使用以下几种方法：

1.文献查阅：

查阅相关的科学文献是获取细胞系特异性生物标志物的主要方法。通过阅读研究这些细胞系的科研人员发表的研究文章，你可以找到他们在研究过程中使用的或者识别的生物标志物。

2.数据库查询：

有些生物信息数据库包含了大量的细胞系和相关的生物标志物信息。例如，NCBI（美国国立生物技术信息中心）的Gene Expression Omnibus（GEO）和European Bioinformatics Institute的ArrayExpress都可以用来查找基因表达数据，从中找出某种细胞系的生物标志物。

3.实验验证：

如通过转录组学和蛋白质组学等高通量技术，对目标细胞系进行全面的基因表达和蛋白质表达分析。这些分析可以揭示与目标细胞系相关的生物标志物，包括差异表达的基因和蛋白质。也可以选取一些候选的生物标志物进行验证实验。如免疫染色、免疫印迹、定量PCR等实验方法，以确定这些标志物是否在目标细胞系中表达，并且是否具有细胞系特异性。

关于你提到的HK-2细胞系，这是一个来源于正常人肾脏上皮细胞的永生化细胞系，常被用作研究肾脏疾病的模型。HK-2细胞一般会表达许多肾脏上皮细胞的标记物，如AQP1, AQP2等。你可能需要查阅有关这个细胞系的研究文章，或者在上述的数据库中查询，找出表达在这种细胞系中的特异性或者丰富的基因或者蛋白质，这些可能就是HK-2的生物标志物。

Q2.一个蛋白一个化学药物小分子可以采用GST PULL down吗？

A:

GST Pull-Down 实验主要用来鉴定蛋白-蛋白间的相互作用。这种方法的原理是通过转基因方式将目标蛋白质与谷胱甘肽 S-转移酶（Glutathione S-transferase, GST）基因融合，利用GST蛋白与谷胱甘肽(Glutathione)的高亲和性，将GST融合蛋白与小鼠抗-GST抗体偶联的免疫磁珠结合，然后通过洗涤步骤去除非特异性结合的蛋白，最后用SDS-PAGE或免疫印迹方法检测与GST融合蛋白特异性结合的蛋白。

因此，GST Pull-Down可能不是研究一个蛋白和一个化学药物小分子的相互作用的最佳选择。因为相比于蛋白质-蛋白质之间的相互作用，小分子-蛋白质的相互作用往往更难通过这种方法在生理条件下稳定地检测出来。小分子化合物通常没有足够的结构复杂性或尺寸来形成稳定的、可以被拉下的复合物。其次，小分子很难被直接固定到磁珠上而不改变其活性或与蛋白质的相互作用。此外，GST Pull-Down技术需要使用特殊的缓冲液和洗涤步骤，这些条件可能会影响小分子与蛋白质之间的相互作用。而且，这种方法通常需要较大量的样本，并且结果可能受到融合标签的影响。

相对而言，研究蛋白质和小分子化学药物之间的相互作用，更常用的方法有表面等离子共振（SPR）、同位素稀释质谱法（ID-MS）以及荧光共振能量转移（FRET）等，这些方法能直接测量小分子与蛋白质的结合，且可在生理条件下进行。当然，哪种方法最适合会根据具体的实验目标和条件来确定。

Q3.Blue native跑类囊体复合体蛋白，分离不开什么原因？超级复合体堆积。

A:

Blue Native PAGE (BN-PAGE)主要用于研究蛋白质复合物的组成和结构，尤其是膜蛋白和大型蛋白质复合物。如果您发现在进行BN-PAGE时，类囊体复合体蛋白的超级复合体无法分离，可能存在以下几个原因：

1.样品处理不当：

蛋白质样品的制备和处理是BN-PAGE成功的关键。如果在样品制备阶段蛋白质复合物已经发生了降解或者聚集，那么在接下来的电泳过程中就可能出现蛋白分离不开或者堆积的情况。

2.电泳条件不适应：

电泳条件如电压、电流、缓冲液和电泳时间等的选择也会影响蛋白质的分离。BN-PAGE的电泳条件需要根据待测蛋白质复合物的特性来进行适当的调整。如果电泳条件不适应，可能会导致蛋白质复合物不能完全进入凝胶，或者在电泳过程中发生堆积。

3.缓冲液中的洗涤剂浓度和种类：

BN-PAGE涉及到使用洗涤剂来溶解和稳定蛋白质复合物。如果洗涤剂的选择不当或者浓度不适，可能会改变蛋白质的疏水性或电荷，从而导致超级复合物的蛋白质无法分离。

4.蛋白质浓度过高：

如果蛋白质浓度过高，可能会导致超级复合体的形成，从而阻止了正常的分离。

5.蛋白质复合物的本身性质：

某些蛋白质复合物之间的相互作用非常紧密，不易分离。例如，如果存在强烈的非共价键或者其他稳定的相互作用（如疏水相互作用），这些超级复合物可能难以在电泳过程中被分离。

以下是一些可能的解决策略：

1.优化样品制备：

确保在样品制备过程中，避免蛋白过度加热或者长时间放置导致降解。尝试使用不同的蛋白提取缓冲液，或者调整缓冲液中的洗涤剂浓度。

2.调整电泳条件：

可以调整电泳电压和电泳时间，尝试温和的电泳条件以避免蛋白质聚集。此外，低浓度的聚丙烯酰胺凝胶可能有助于大型蛋白质复合物的分离。

3.更换洗涤剂：

BN-PAGE常用的洗涤剂是DDM（n-十二烷基-β-D-吡喃醣苷），但有时对某些蛋白复合体来说效果可能不理想。可以考虑使用其他类型的洗涤剂，如Triton X-100或者CHAPS。

4.二维电泳：

如果单纯的BN-PAGE无法有效分离蛋白，可以尝试二维BN/SDS-PAGE。第一维使用BN-PAGE分离蛋白复合体，然后对每个复合体进行第二维SDS-PAGE，这样可以进一步分离复合体的各个组分。

5.使用化学交联剂：

为了更好地保持蛋白质复合体的结构，可以在样品制备阶段使用化学交联剂，如BS3或者DSS。

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