蛋白分析常见问题与解答（十二）

Q1.从植物种子中纯化了蛋白酶，具有转化特定反应活性。但数据库里并没有该酶的比对信息，该怎么鉴定这个蛋白？

A:

鉴定从植物种子中纯化出的未知蛋白酶需要综合利用多种生物化学和分子生物学方法。以下是鉴定这种蛋白酶的建议步骤：

1. 蛋白酶活性测定：

首先要确认这是一个具有酶活性的蛋白。可以针对你提到的“转化特定反应”来设计酶活性测定实验。

2. 分子量测定：

使用SDS-PAGE (硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳) 来确定蛋白的大致分子量。

3. 氨基酸序列测定：

从N端开始测序蛋白的氨基酸序列。这样至少可以获得蛋白的部分氨基酸序列，从而为下一步的cDNA克隆提供线索。

4. cDNA克隆和测序：

利用上述的部分氨基酸序列设计RT-PCR的引物，克隆出蛋白对应的cDNA，并对其进行测序。

5. 生物信息学分析：

使用获得的cDNA序列进行生物信息学分析，如同源性比对、结构预测和功能预测等。

6. 表达和纯化重组蛋白：

将克隆的cDNA插入适当的表达载体中，然后在宿主细胞中表达。从宿主细胞中纯化出重组蛋白，并确认其具有与从种子中纯化出的原始蛋白相同的酶活性。

7. 蛋白质组学分析：

使用质谱技术对蛋白进行进一步的鉴定和分析。

Q2.请教一些多肽的知识，如何计算氨基酸的投入量？

A:

在多肽合成中，氨基酸投入量的计算需要根据你的合成策略和反应条件来确定。一般来说，你需要考虑的因素包括：1.氨基酸的摩尔量（moles）：这是你计划合成的多肽的摩尔数，以及每个氨基酸在多肽中的摩尔比例。例如，如果你计划合成1摩尔的多肽，而这个多肽的序列中包含了3个丙氨酸，那么你就需要3摩尔的丙氨酸。2.反应的效率：在实际的合成过程中，由于各种原因（如副反应，氨基酸的不完全耦合等），你可能不能得到所有的理论产物。因此，你可能需要投入超过理论计算值的氨基酸来保证足够的产量。通常，你可以预期的耦合效率为约95%-98%。

下面我通过这个具体的例子来解释如何计算氨基酸的投入量：

假设你准备合成一个简单的三肽，如Gly-Phe-Leu，并且你计划合成1mmol的该三肽。假设你预计的耦合效率为95%。对于Gly，Phe，Leu，假设他们的摩尔质量分别为75，165，131 g/mol。具体的计算步骤如下：

1.计算理论摩尔数：

首先，由于你计划合成1mmol的三肽，且三肽的序列中每个氨基酸只有1个，所以你需要1mmol的每种氨基酸。这就是理论上需要的氨基酸摩尔数。

2.考虑耦合效率：

然后，考虑到95%的耦合效率，你实际上需要的每种氨基酸的摩尔数为1mmol/0.95≈1.05mmol。

3.计算质量：

接下来，你可以通过将摩尔数乘以摩尔质量来计算每种氨基酸的质量。对于Gly，质量为1.05mmol75g/mol≈79mg。对于Phe和Leu，类似地，质量分别为1.05mmol165g/mol≈173mg和1.05mmol*131g/mol≈138mg。

这样，你就可以知道在反应中需要投入79mg的Gly，173mg的Phe和138mg的Leu。

这只是一个简单的例子，实际的多肽合成可能会更复杂，并可能需要考虑更多的因素，例如保护群的策略，溶剂的选择，以及反应条件等。

Q3.交联法蛋白相互作用分析有没有具体的实验方法？怎么选择交联剂？

A:

一、交联法蛋白相互作用分析的大致步骤主要包括交联反应、蛋白质分离和检测。以体外交联实验为例：

1. 交联反应：

首先将待分析的蛋白质溶液与交联剂混合，使其在适当的条件下进行交联反应。交联剂可以是化学交联剂或光敏交联剂。化学交联剂常用的有二氧化硅（DSS）、èr yǎng huà liú（Sulfo-EGS）等，光交联剂常用的有二氧化硅（DSP）、èr yǎng huà liú（Sulfo-EGS）等。选择交联剂时需要考虑其交联效率、稳定性和对蛋白质结构的影响。

2. 蛋白质分离：

交联反应后，添加反应终止剂（例如甘氨酸）来停止交联剂的活性，避免继续交联，并用适当的方法从样品中提取交联的蛋白质复合物，然后利用SDS-PAGE或其他方法将蛋白质复合物进行分离。

3. 检测：

分离后的蛋白质可以通过Western blot、质谱等方法进行检测。Western blot是一种常用的蛋白质检测方法，通过将蛋白质转移到膜上，然后使用特异性抗体进行检测。质谱是一种高通量、高灵敏度和高准确性的方法，可以对互作蛋白进行定性和定量鉴定。

二、关于交联剂的选择

1.交联效率：

交联剂应具有较高的交联效率，能够有效地将蛋白质交联在一起。

2. 稳定性：

交联剂应具有较好的稳定性，能够在交联反应过程中保持其活性。

3.对蛋白质结构的影响：

交联剂应对蛋白质结构的影响较小，避免对蛋白质的功能和结构造成不可逆的影响。

常用的交联剂及适用性如下：

1.二巯基丙二酸（DTBP）:

是一种较为温和的交联剂，交联作用是可逆的，交联后的蛋白质复合物可以在一定条件下解离，DTBP可在较小的交联距离（通常在几纳米到十几纳米之间）内连接蛋白质，适用于固定近距离的相互作用。

2.二(氢氧化)亚胺（DSS）：

DSS 是最常用的化学交联剂之一。它是一种带有两个氨基和两个亚硫酸基的化合物。DSS 适用于水溶性蛋白质，并且能够在较温和的条件下进行交联。 适用于稳定较远距离的蛋白质相互作用。

3.芳香族二酮（例如：Benzophenone）：

这些化合物在紫外线照射下会产生高度反应性的激发态，从而进行光敏交联。光敏交联剂在一些情况下比化学交联剂更具选择性和灵敏度，因为可以通过精确控制照射位置来实现交联。

4.苯并芘酮（例如：Pyrroloquinoline quinone，PQQ）：

PQQ 是另一种常用的光敏交联剂，与芳香族二酮类似，可以在紫外线照射下形成高度反应性的激发态。

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